Hvad er fermentering?

Svampe er utroligt vigtige i bioteknologi, fordi de kan bruges til fermentering. Kombucha er et eksempel på en fermenteringsproces der let kan udføres derhjemme, og som samtidigt tager fat i den store faglige videnskab, der ligger bag. I det følgende afsnit kan du læse om fermentering, løse opgaver og udføre et projekt omkring kombuchabrygning.

PROJEKT GUIDE

Hent guiden til et projektforløb om at brygge din egen kombucha her!

DOWNLOAD

OPGAVER

Hent opgaveark med spørgsmål til projektet

DOWNLOAD

EXCEL

Hent excelark til opgaverne og forstå de kemiske reaktioner

DOWNLOAD

Fermentering er blevet praktiseret i flere årtusinder, og det er blevet brugt som et redskab til at konservere forskellige levnedsmidler på. I dag ved vi en stor del om det der rent faktisk foregår nede på det mikroskopiske niveau, og vi har lært at anvende fermentering til fremstilling af kemiske produkter såsom lægemidler, enzymer og biobrændsel. En klar definition på en fermentering lyder:

“Fermentering er en proces, hvor en kultur af mikroorganismer udnyttes til produktion af et produkt.”


Fermentering handler grundlæggende om hvordan man kan presse celler til det yderste og få dem til at danne maksimale mængder af produkt. De anvendte mikroorganismer kaldes for cellefabrikker, fordi de betragtes som produktionsfabrikker. En simpel måde at forstå en fermenteringsproces på, er ved hjælp af den såkaldte black box model:

I en fermenteringsproces kommer der materialer ind, som bearbejdes af cellefabrikkerne til at danne nye celler og til at producere produkter. De materialer, der kommer ind, kaldes for substrater. Substrater er alle de stoffer som cellerne bruger til at gro. De bliver enten direkte indarbejdet og brugt i cellerne, eller også bliver de kørt igennem en biokemisk reaktionsvej (pathway). Disse reaktionsveje katalyseres ved hjælp af cellens enzymer. Cellens store samling af reaktionsveje betegnes som cellens metabolisme. I black box modellen kan man forestille sig et stort netværk af reaktioner, der fører substraterne til produkter og til nye celler. En celles primære formål er at formere sig, og derfor bliver substraterne særligt brugt til at lave nye celler. Massen af celler kaldes for biomasse. Som et biprodukt af dette udskiller cellerne samtidigt metaboliske produkter.

Her ser vi igen cellen som en fabrik, der optager materialer fra omgivelserne og omdanner dem til produkter, som derefter udskilles.

De materialer, der kommer ind, kaldes for substrater. Substrater er alle de stoffer som cellerne bruger til at gro. De bliver enten direkte indarbejdet og brugt i cellerne, eller også bliver de kørt igennem en biokemisk reaktionsvej (pathway). Den store samling af reaktionsveje betegnes som cellens metabolisme. Cellens primære formål er at formere sig, og derfor bliver substraterne særligt brugt til at lave nye celler. Massen af celler kaldes for biomasse. Som et biprodukt af dette udskiller cellerne samtidigt omdannede metaboliske produkter.

De kemiske forbindelser, der bliver dannet i metabolismen, kaldes for metabolitter. Der skelnes mellem primære og sekundære metabolitter.

Primære metabolitter omhandler de kemiske forbindelser, der dannes i forbindelse med cellernes livsnødvendige processer. Uden dannelse af primære metabolitter vil cellerne ikke kunne opretholde liv. Eksempler på primære metabolitter er fx. aminosyrer, der bruges til at lave proteiner. Et andet eksempel er ethanol i gær og mælkesyre i mælkesyrebakterier, som begge dannes i forbindelse med processen, hvor cellen lader sit energi-batteri op, så der kan foretages energi-nødvendige reaktioner.

Sekundære metabolitter er metabolitter, der produceres af cellen, men som ikke er direkte nødvendige. De sekundære metabolitter bliver produceret af mikroorganismerne, fordi de rent evolutionært har givet dem en evne til at overleve, af forskellige grunde. Et eksempel på en sekundær metabolit er fx penicillin, som produceres af skimmelsvampe. Penicillin er et antibiotikum som slår bakterier ihjel, og kan med fordel bruges af skimmelsvampen til at udkonkurrere bakterier. Antibiotika er et klassisk eksempel på en sekundær metabolit, men ofte finder man sekundære metabolitter, hvis funktion ikke er kendt.

Primære og sekundære metabolitter udgør de ønskede produkter, som man ønsker at producere ved fermentering. En anden vigtig kategori af produkter er proteiner, heriblandt enzymer, som kan bruges i mange Derudover bruges fermentering også til at producere enzymer og andre værdifulde proteiner. Biomasse kan også være det ønskede produkt i sig selv. De danske gærfabrikker producerer omkring 25.000 ton bagegær om året, som sælges i supermarkederne.

Biobrændsel, citronsyre og aminosyrer er nogle eksempler på lav-værdi produkter. For at gøre det økonomisk fordelagtigt er det vigtigt at sørge for, at disse produkter bliver fremstillet under minimale omkostninger og i en høj volumen. Lægemidler og antibiotika er eksempler på høj-værdi produkter. Typisk er disse produkter også sværere at producere, og her er det vigtigste at sørge for at den høje kvalitet er i orden.

Cellefabrik

Der findes et hav af mikroorganismer i naturen og hver af dem har hver deres unikke egenskaber. Fra et teknisk synspunkt betyder dette, at forskellige mikroorganismer kan bruges til forskellige formål. Nogle mikroorganismer er særligt egnede til brug som cellefabrikker alt afhængig af, hvad man har til ønske at producere. Antibiotikummet penicillin bliver naturligt produceret af skimmelsvampe, heriblandt særligt Penicillium chrysogenum, og derfor er det en naturlig god cellefabrik til penicillin-produktion. Gæren Yarrowia lipolytica har fået interesse at produktion af lav værdi-produkter, da den er god til at bruge glycerol som substrat, som er et affaldsprodukt ved biobrændsel produktion.

Ideelt set ønsker man at bruge cellefabrikker, der bruger størstedelen af dens energi på at danne det ønskede produkt. Men hvis al energien gik til at producere produkt, vil cellerne ikke overleve, da det stadig er nødvendigt for dem at holde sig selv i live. Det er desuden vigtigt at sørge for at der også dannes biomasse, da flere celler giver mere produkt. Derfor handler det om at finde en balance mellem cellefabrikkernes primære metabolisme og den metabolisme, der allokeres til dannelsen af produkt. Vækstraten angiver hvor meget biomasse der dannes per tid. En udbyttekoefficient angiver, hvor mange gram produkt der dannes per gram substrat, der bruges. Produktiviteten angiver, hvor meget produkt der dannes over tid. Disse koefficienter bør være høje i den cellefabrik, man ønsker at bruge. Derudover er det også vigtigt, at udbytter af andre uønskede produkter er lave.

Moderne bioteknologi gør det muligt at optimere cellefabrikkerne ved at foretage genetiske ændringer. Ved hjælp af genteknologi, som f.eks. CRISPR/Cas9, kan man (1) optimere produktion af det ønskede produkt, (2) afskaffe produktionen af uønskede biprodukter og (3) indsætte nye funktioner, der naturligt ikke vil foregå i cellefabrikkerne. Heterolog ekspression er når udefrakommende gener indsættes og udtrykkes i en vært, som normalt ikke har disse gener. Et eksempel på dette er produktionen af peptidhormonet insulin, der bruges til behandling af diabetikere. Tidligere har man skaffet insulin fra bugspytkirtlen fra grise og køer, men i dag bliver insulin produceret ved heterolog ekspression i gæren Saccharomyces cerevisiae, som naturligt aldrig vil producere dette produkt.

De cellefabrikker, der bruges i dag, tilhører groft en af følgende fire grupper:

Bakterier. Prokaryote organismer som er simple at arbejde med. Bakterier har rigtig hurtig vækst. Anaerobe bakterier kan gro uden tilførsel af ilt, hvilket kan være en stor fordel ved fermentering. Bacillus subtilis er en kendt cellefabrik og bruges bl.a. til produktion af enzymer som amylase og proteaser.

Gær. Enkeltcellede svampe som ofte har hurtig vækst. Gær er de mest simple eukaryote cellefabrikker. Nogle produkter kan bedst produceres i en eukaryot cellefabrik, og her er gær oplagt at bruge. Saccharomyces cerevisiae er den mest anvendte gær og har været brugt i årtusinder, og bruges nu også til heterolog ekspression.

Skimmelsvampe. Flercellede svampe med hurtig vækst. De er strikt aerobe. Skimmelsvampe producerer mange forskellige værdifulde sekundære metabolitter, og er naturligt gode til at udskille enzymer. Skimmelsvampe klumper sammen på grund af deres dannelse af hyfer, hvilket kan give ophav til udfordringer i forhold til tilførsel af næring. Aspergillus niger producerer store mængder af citronsyre og bruges også til produktion af forskellige enzymer.

Mammale celler. Disse celler har langsom vækst og er strikt aerobe. Pga. post-translationelle modifikationer kan cellerne fremstille produkter, der er identiske til dem, kroppen selv danner. Dette er en nødvendighed for mange farmaceutiske produkter. Cellerne kan kun leve i meget omkostningsfulde vækstmedier, og begår apoptose, hvis vækstbetingelserne ikke er perfekte. Chinese hamster ovary (CHO) celler bruges ofte som mammale celler.

Følgende tabel kan bruges til at beskrive karakteristika for ens mikroorganisme:

Tillægsord Betydning
Aerob
Anaerob
Strikt anaerob
Fakultativt anaerob
Acidofil
Halofil
Xerofil
Barofil
Oligotrof
Autotrof
Heterotrof
Fototrof
Kemotrof
Psykrofil
Mesofil
Termofil
Kan gro med ilt
Kan gro uden ilt
Kan kun gro uden ilt
Kan både gro med og uden ilt
Tåler lav pH
Tåler høje saltkoncentrationer
Tåler lav fugtighed ()
Tåler højt tryk
Kan gro ved lavt næringsindhold
som carbon-kilde
Organiske forbindelser som carbon-kilde
Sollys som energi-kilde
Kemiske forbindelser som energi-kilde
Tåler lave temperaturer
Tåler moderate temperaturer
Tåler høje temperaturer

Vækstbetingelser

For at fuldføre en succesfuld fermentering er det altafgørende at sørge for at cellerne har det tilpas godt i processen. Dette opnås ved at opfylde deres vækstbetingelser. Fermenteringen foretages i et vækstmedium, som indeholder de substrater, der er nødvendige for mikroorganismernes overlevelse. Derudover er det vigtigt at temperatur og pH holdes inden for det område, der er optimalt for cellefabrikkerne. Som minimum er der taget højde for følgende fem bestanddele i et vækstmedie:

Vand er den allermest nødvendige betingelse for alt liv. Derfor udgør vand også den største bestanddel af ens vækstmedium. I et medie bruges vand til at holde mediet homogent og til at styre temperaturen. Mineralvand indeholder desuden mineraler, som er et af de andre altafgørende bestanddele i et vækstmedium.

Energi er altafgørende for, at mikroorganismerne kan foretage deres metaboliske processer. I de få tilfælde, hvor man arbejder med fotoautotrofe organismer, såsom planter, kan energien komme fra lys. Typisk arbejder man med kemo-organotrofe mikroorganismer der bruger energi-rige organiske forbindelser som energi-kilde, såsom sukker. Her tilføres energi i form af carbon-kilden.

Carbon er den mest brugte byggesten i celler ud af alle grundstoffer, og det indgår i alle organiske forbindelser. Derfor bør det udgøre en betydelig del af vækstmediet. Udover dette er carbon-kilden som sagt også oftest kilden til energi. Den mest almindelige carbon-kilde er sukkerstoffer som f.eks. glukose. Alternativt kan man også bruge olier, fedtsyrer og alkaner.

Nitrogen er også en vigtig byggesten i mikroorganismer der bruges i alle mikroorganismer. Nitrogen indgår i aminosyrer, DNA samt andre vigtige forbindelser i cellen. Nitrogen kan komme fra både uorganiske forbindelser som ammonium og nitrat, eller organiske forbindelser som aminosyrer eller proteiner.

Mineraler er gruppen af alle de undertegnede grundstoffer, som mikroorganismer skal bruge i små koncentrationer. Eksempler på nogle af de mange mineraler er: fosfor, kalium og jern, zink og kobber. Mineraler kan findes i små koncentrationer som urenheder fra andre kilder, såsom mineralvand.

I nogle fermenteringsprocesser kan man også være nødt til at tilsætte vitaminer, som er essentielle stoffer som cellefabrikken ikke selv kan syntetisere, men som er livsnødvendige. Når man f.eks. fermenterer med mammale celler skal en lang liste af vitaminer tilsættes for at cellerne kan overleve.

I mange tilfælde fermenteres der ofte med aerobe cellefabrikker, som kræver ilt. Ilt er et vanskeligt substrat, da det kun kan tilføres på gasform, hvilket gør det svært at fordele ligeligt ud i en tank. Måden man tilfører ilt under en fermentering, er ved at boble det ind i små bobler, og sørge for at boblerne bliver brudt op af en rotor.

Et vækstmedie inddeles alt efter om det er komplekst eller minimalt:

Komplekst medium Minimalt medium
Et medium hvor indholdet af de kemiske forbindelser er udefineret. Det udgøres af komplekse næringskilder som fx yeast extract og corn-steep liquor, som indeholder mange forskellige stoffer. Komplekst medium bruges ofte i industrien. Et veldefineret medium, der indeholder præcis det, man har designet det til. I et minimalt medium vil man fx tilsætte en ren glukose, og rene salte. Man vil bruge demineraliseret vand og tilsætte mineralerne ved siden af. Minimalt medium bruges ofte i forskning.

.

Fordelen ved et komplekst medie er, at det typisk er billigere at bruge. Desuden vokser cellefabrikker meget ofte hurtigere i et komplekst medie, da det indeholder mange forskellige substrater. Cellefabrikken kan optage de fornødne stoffer, den skal bruge, i stedet for at syntetisere dem fra bunden af. Et minimalt medium er imidlertid foretrukket til videnskabelige formål, da vækstmedie-kompositionen er veldefineret. Man kan derfor foretage nøje beregninger og opstille modeller, som ellers ikke vil være muligt at gøre i et komplekst medium. Det er nemmere at reproducere en fermentering med et minimalt medie, og man har bedre kontrol af hvad der foregår.

Bioreaktor

Formålet med en bioreaktor er at sikre et lukket, kontrolleret og homogent miljø hvor fermenteringen kan foregå på en måde der både er sikkert og praktisk. Som standard for alle industrielle bioreaktorer er der indbygget et temperatur- og pH-kalibreringssystem, som justerer temperatur og pH til det bedste optimum for cellefabrikkerne. Under fermentering udvikles der varme, som sænkes ved et kølingsanlæg. Derudover falder pH også i takt med anaerobe processer og citronsyre-produktion med filamentøse svampe, hvilket modvirkes ved indførelse af base. Ilt bobles ind fra bunden og homogeniseres sammen med resten af vækstmediet ved hjælp af rotorer.

En bioreaktor bør indrettes således, at der skabes maksimale mængder af udbytte af produkt. En bioreaktor kan indrettes på tre forskellige måder, som hver har deres fordele og ulemper: batch, kemostat og fed-batch.

Batch

En batch bioreaktor er den mest simple måde at operere en fermentering på. Ved en batch foregår fermenteringen i et komplet lukket system, hvor der ikke forstyrres ved fermenteringen. Når der ikke dannes mere produkt, ekstraheres tankens indhold, og produktet oprenses. Udviklingen af substrat og biomasse vil typisk se således ud:

Begyndelsen af en batch-fermentering kaldes for nølefasen (lag-fasen), hvor kulturen af cellerne vænner sig til de givne omstændigheder. Herefter indtræffer den eksponentielle vækstfase; kulturen har fundet sig til rette og begynder at formere sig ved eksponentiel vækst. På et tidspunkt begynder denne vækst at flade og går over i den stationære fase uden vækst. Årsagen til dette er ofte at substratkilden er opbrugt, men der kan være andre forklaringer. For eksempel kan det dannede produkt være nået toksiske koncentrationer. Efter en tidsramme indtræffer dødsfasen, hvor de levende celler begynder at dø.

Produktdannelsen af metabolitter i en batch-fermentering afhænger af, om der er tale om en primær eller sekundær metabolit. Hvis det er en primær metabolit, produceres det samtidig med normal vækst, og derfor vil store mængder blive produceret under den eksponentielle vækstfase. Ofte bliver de sekundære metabolitter først produceret i den stationære fase. Dette skyldes, at produktionen af sekundære metabolitter ofte reguleres af en stress-faktor, som for eksempel manglen på substrat. I naturen vil dette fænomen skyldes, at de sekundære metabolitter måske vil kunne hjælpe dem gennem denne stress-faktor ved f.eks. at dræbe nærliggende bakterier med antibiotika.

Kemostat

En kemostat er en udvidet form af en batch, hvor der er tilsluttet en slange med flow ind og en slange med flow ud af tanken. Et problem ved batch-fermentering er, at den stopper så snart der ikke er mere substrat tilbage i mediet. En kemostat forsøger at løse dette ved på et tidspunkt at tømme for indholdet af tanken, og fylde nyt frisk vækstmedie på. Flow ind og ud er det samme, og dermed kan der holdes der en konstant volumen. En kemostat kaldes også for en kontinuerlig fermentering, idet der er et konstant flow gennem tanken.

Steady state betegner et miljø hvor alle koncentrationer af substrat, produkt og biomasse holdes konstante i bioreaktoren. Dette miljø kan opnås ved en kemostat-fermentering. Det opnås ved at cellernes vækstrate, substratindtag og produktdannelse udligner den kontinuerlige fortynding af vækstmediet. På den måde ophobes hverken substrat, produkt eller biomasse i tanken. Ved steady state kan en kemostat teoretisk set fortsætte i en uendelighed.

Kemostat bruges i industrien, men har særligt mange anvendelser i forskning, da man kan bruge steady state til at bestemme nogle af de forskellige parametre, som f.eks. udbyttekoefficienter.

Når en cellefabrik forsynes med rigelige mængder af en foretrukken carbon-energikilde, såsom glukose, kan det resultere i carbon catabolite repression. Dette er et regulatorisk system som cellen bruger til at slukke for unødvendige funktioner. Rigtig mange metaboliske reaktionsveje er underlagt dette regulatoriske system, og det kan resultere i, at man ikke får dannet sit ønskede produkt i en batch fermentering, fordi substratkoncentrationerne enten er rigtigt høje eller helt tømte. Dette problem kan løses ved kemostat ved at holde en kontinuerlig lav substrationkoncentration.

Der er fordele og ulemper ved brug af en kemostat. En af fordelene er, at man kan holde en konstant lav koncentration af substrat, hvilket ofte foretrækkes. En kemostat kan desuden fortsætte i en uendelighed, men det betyder også, at der er en øget risiko for kontaminering. En kemostat er ikke et lukket system, og man skal derfor sørge for, at der ikke kommer uønskede mikroorganismer ind i processen. Det sker også ofte, at mikroorganismernes produktivitet falder efter nogen tid, hvilket skyldes at man arbejder med en ustabil stamme, hvor de vigtige gener for produktdannelse ændres.

Fed-batch

Den tredje og sidste måde at operere en fermentering på, er en fed-batch. Ofte er fed-batch den løsning, der giver det største udbytte af produkt. Ligesom en kemostat forsøger man at løse det samme problem i en batch, nemlig at man på et tidspunkt løber tør for næring. Der bliver derfor hældt frisk medie ind, men i modsætning til en kemostat, er der ikke noget flow ud. Flow ind i tanken stiger eksponentielt i tråd med den eksponentielle vækst, og samtidig stiger volumen i tanken. Den afgørende faktor er derfor størrelsen af tanken. Fed-batch er den mest almindeligt brugte fermentering i industrien fordi der kan opnås meget høje produkt-koncentrationer i vækstmediet.

Batch Kemostat Fedbatch
Nem, lav risiko for kontaminering, al substrat bliver opbrugt. Effektiv, kan vedligeholdes i lang tid, konstant produktkoncentration. Substratkoncentrationer og volumen kan justeres nemt, høje produktkoncentrationer kan opnås.
Kræver meget arbejdskraft, substratkoncentration er enten meget høj eller forsvunden. Risiko for kontaminering, ikke velegnet til ustabile stammer, ufleksibel, ikke alt substrat opbruges. Nogle af de samme udfordringer som i batch og kemostat, men mindre markante.